1. 실험목적

미생물 배양은 미생물연구의 첫 단계로써 매우 중요하다. 미생물은 반드시 각 미생물에게 적절한 환경에서 반복적으로 배양 될 수 있어야 한다. 직접 배지를 만들고 미생물을 배양해봄으로써 미생물 배양의 기본원리를 안다.

2. 미생물(Microorganism)

주로 단일세포 또는 균사로써 몸을 이루며, 생물로서 최소 생활단위를 영위한다. 남조류, 균류, 원생동물류, 사상균류, 효모류와 한계적 생물이라고 할 수 있는 바이러스(virus) 등이 이에 속한다. 이들은 지구상 어디에서나 습기가 있는 곳에는 생육할 수 있으며 인간생활과 밀접한 관계가 있다. 사람을 비롯한 동식물에 질병을 가져오는 병원미생물, 독소를 생성하여 식중독을 일으키는 미생물, 의식주에 관계되는 각종 물질을 변질 ·부패시키는 원인 생물인 유해미생물도 잘 알려져 있다. 이러한 미생물의 특유한 성질을 이용하여 식품 ·의약품 그 밖의 공업생산품 등 생산공업에도 많이 이용하며, 간편한 시설로써 계속 배양시킬 수 있는 생물자원으로도 각광을 받고 있다. 미생물의 균주개발에는 유전자공학적인 방법이 도입되어 이용되고 있다. 자연계에서는 동식물의 시체 ·배설물 ·부후물 등을 분해하는 청소부 역할을 함에 따라 수질환경 및 토양의 지력보존에도 이들 미생물이 많이 이용되고 있다.

미생물을 키우기 위해서는 영양분을 필요로 한다. 균류는 가장 원시적인 형태이지만 여러 가지의 단순하거나 복잡한 요소들로 이루어져 있으며, 매우 다양한 물질대사를 한다. 미생물이 필요로 하는 에너지원과 영양소에 따라 여러 그룹으로 분류가 가능하다.

3.미생물배양(Microbiological culture)

미생물 배양은 미생물의 특징을 알아내거나, 그 수를 늘리기 위해서 미생물을 키우는 방법이다. 가장 많이 쓰이고 일반적인 방법은 plate를 이용하는 방법으로, 아가를 함께 사용한다. 일반적으로 미생물 배양은 인큐베이터 안에서 이루진다.

미생물이 자라기 위해서는 일정한 에너지원, 영양분 공급 등 안정적인 환경이 필요하다. 이러한 환경에는 화학적인 요소와 생리적 요소로 나눌 수 있다.

화학적 요소로는 탄소, 수소, 산소, 질소, 인, 황, 칼륨 등이 있으며 자연에서 존재하는 형태와 유사한 형태로 미생물에 공급되어야 한다. 생리적 요소로는 온도, pH, 삼투압, 산소의 유무, 물, 이산화탄소가 있으며, 최적의 생리활동이 이루어질 수 있도록 미생물에 따른 최적의 조건을 만들어 주어야 한다.

4. 배지(medium)

미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하고, 다시 특수한 목적을 위한 물질을 넣어 혼합한 것이다. 미생물이나 cell의 종류에 따라 각기 다른 배지를 사용하게 된다. 생물은 생존 ·발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질로서 다량요소 ·미량요소 등을 요구한다. 그 중 기체상으로 얻어지는 것을 제외하고는 모두 무기 또는 유기화합물로서 배지에 공급해 주어야 한다. 필요한 화합물은 독립영양 ·종속영양 등 영양 형식에 따라 여러 가지이다. 보통 영양원을 탄소원 ·질소원 ·무기염류 ·발육인자(비타민류) 등으로 나누어서 생각한다. 특히 발육인자와 관련하여 생물체에서 추출한 비교적 복잡한 조성을 가진 것을 주체로 한 경우를 천연배지(天然培地)라고 한다.

세균배양에는 육즙 ·혈청 등이, 곰팡이배양에는 맥아추출물 등이 흔히 사용된다. 이에 대하여 무기염류만 또는 구조가 확실한 탄소원 ·질소원을 가한 조성이 명확한 경우를 합성배지(合成培地)라고 한다. 대량 배양에는 액체배지가 적당하고, 주(株)의 보존이나 분리에는 한천 ·젤라틴 등을 가한 고형배지를 사용한다. 많은 종류의 세균을 포함하는 재료로부터 목적균을 추출하기 위한 배지를 선택배지라고 한다. 배지는 완전히 멸균한 후에 목적균을 심지 않으면 잡균이 증식될 염려가 있고, 배지를 보존하기 위해서도 반드시 멸균이 필요하다.

(1)배지의 종류

1) 재료에 따른 분류

① 천연배지 : 배지 재료가 천연물로서 그 화학 조성이 확실히 알려져 있지 않은 배지다. 미생물의 정확한 생육소를 모를 때, 생육소의 요구량이 많을 때 사용한다. 감자한천, Oat meal 배지, 볏짚 배지, Nutrient broth 배지 등이 있다.

② 합성배지 : 화학 조성이 알려져 있는 재료만으로 만들어진 배지로서 Czapek- Dox 배지 등이 있다.

③ 반합성배지 : 합성배지의 성분의 일부를 peptone, Yeast extract 등 화학 조성이 밝혀지지 않은 천연물로 바꾸어 놓은 배지이다.

2) 사용형태에 의한 분류

① 고체배지 : 액체배지에 agar, 젤라틴, 실리카겔 등을 첨가하여 굳힌 것으로 고체배지는 미생물의 보존 배양, 순수 분리 등에 사용된다. 고체배지는 평판배지, 고층배치, 사면배지 등이 있으며 목적에 따라 사용 방법이 다르다. agar 등의 고형제의 함량은 사용목적에 따라 바뀐다.

② 액체배지 : 미생물의 생리, 화학적 연구나 미생물의 대량 배양에 사용된다.

3) 사용 목적에 따른 분류

① 보통배지 - 보통배지는 될 수 있는 한 많은 미생물이 생육 할 수 있도록 제조된 배지로 세균용으로는 Nutrient broth, Nutrient agar를 곰팡이용으로는 감자한천 배지 등이 이용된다.

② 특수배지 - 특수배지는 선택배지, 판별배지, 증식배지, 생화학적 시험용 배지 등이 있다.

- 선택배지 : 목적하는 미생물의 생육을 증진시키고 다른 미생물의 생육을 억제되도록 만     들어진 배지로 토양, 병든 조직에서 목적하는 균을 분리 배양하기 위해서 많은 선택배지     가 고안되었다.

- 판별배지 : 미생물의 생화학적 성질을 이용하여 여러 미생물이 혼재 되어 있는 곳에서 목    적으로 하는 미생물을 판별, 확인하기 위해 만들어진 배지이다.

- 증식배지 : 보통배지에서는 생육이 잘 안되는 미생물이나, 생육이 나쁜 미생물의 생장,      증식을 촉진시키는 것을 목적으로 하는 배지이다.

- 생화학적 성질 조사를 위한 배지 : 세균의 분류, 동정을 위한 배지.

(2)배지 성분

1) 육즙 및 대용 육즙 : 일반 세균에 많이 사용한다. 육즙은 수육의 침출액을 농축한 것이기 때문에 육중의 가용성 질소화합물과 비타민 등의 생육촉진 인자, 무기염류가 풍부하여 미생물의 배양에 광범위한 세균 배양에 사용하고 있다.

2) 효모즙 (Yeast extract) : 아미노산, 비타민류, 무기염류를 풍부하게 함유하고 미생물 배양에 광범위하게 사용한다.

3) Peptone : 밀크카제인, 수육, 대두단백 등을 단백분해효소로 가수분해한 것이기 때문에 각종 아미노산과 질소화합물이 주성분이다. 어떤 원료를 어떤 효소로 분해하였나에 따라 조성이 다르다. casein peptone은 인돌생성 시험에는 적당하지만 황화수소 생성시험에는 그다지 적당하지 않다. 수육 peptone은 광범위한 세균의 생육에 적당하고, 대두 peptone은 탄수화물과 티아민이 풍부하여 균류를 포함한 많은 미생물의 생육에 적당하지만 단독으로는 영양이 나쁘기 때문에 다른 peptone과 병용하는 것이 좋다.

4) 우유 : 유산균의 배양에 이용한다.

5) 혈청 : 병원성 미생물의 배양에 이용한다.

6) 양파즙 (Onion extract) : 곰팡이 등 식물 병원균의 배양에 이용한다.

7) 맥주 : 초산균, 유산균, 산막효모 등의 배양에 이용한다.

8) Liver extract : 혐기성 세균의 분리와 배양에 이용한다. 많은 생육촉진인자를 포함하고 있어 영양 요구가 복잡한 미생물의 배양에 적합하다.

9) 맥아즙 : 곰팡이, 효모 등의 균류의 배양에 적합하며 주성분은 맥아당(maltose)이다.

10) agar : 홍조류에서 추출한 복합 다당류로 100℃에서 녹아 배양 시 고체 상태를 유지 할 수 있다. 일단 녹으면 45~50℃까지 액체 상태를 유지한다. 단단하고 투명한 gel을 형성하여 colony 관찰이 용이하다. 복합탄수화물이라 bacteria에 의한 분해와 소화가 거의 없어 liquefaction이 거의 없다.

11) 이외 여러 가지 영양분(C, H, O, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe등)들이 무기물 상태로 공급가능하다.

Requirements for Growth	Form usually found in Nature	Chemical Form commonly added to Microbiological Media
Carbon	Carbon dioxide (CO2), HCO3- organic compounds	Organic; simple sugars e.g. glucose, acetate or pyruvate; extracts such as peptone, tryptone, yeast extract etc. Inorganic; carbon dioxide (CO2) or hydrogen carbonate salts (HCO3-)*
Hydrogen	Water (H2O) organic compounds
Oxygen	Water (H2O), oxygen gas (O2), organic compounds
Nitrogen	Ammonia (NH3), nitrate (NO3-) organic compounds e.g. amino acids nitrogen gas (N2)	Organic; amino acids, nitrogenous bases Inorganic; NH4CI, (NH4)2S04, KNO3, and for dinitrogen fixers N2
Phosphorus	Phosphate (PO43-)	KH2PO4, Na2HPO4*
Sulphur	Hydrogen sulphide(H2S), sulphate (SO42-), organic compounds e.g cysteine	Na2SO4, H2S
Potassium	K+	KCI, K2HPO4*
Magnesium	Mg2+	MgCI2, MgSO4
Calcium	Ca2+	CaCI2, Ca(HC03)2*
Sodium	Na+	NaCI
Iron	Fe3+ organic iron complexes	FeCI3, Fe(NH4)(SO4)2, Fe-chelates1)
Trace elements	Usually present at very low concentrations	CoCI2, ZnCI2, Na2MoO4, CuCI2, MnSO4, NiCI2, Na2SeO4, Na2WO4, Na2VO4
Organic growth factors	Usually present at very low concentrations	Vitamins, amino acids, purines, pyrimidines

실험 재료

멸균기(autoclave), 멸균테이프, 증류수, 여과기, 주사기, 호일, plate, 플라스크, NaCl, Tryptone, Yeast extract, Agar, Peptone, 루프,

대장균(Escherichia coli), 유산균(Lactobacilus)

실험방법

1. Luria Bertani (LB) 배지 만들기

1) 삼각플라스크에 증류수 300ml을 넣는다.

2) 삼각플라스크에 NaCl 3g, yeast extract 1.5g, tryptone 3g, Agar 4.5g을 각각 넣고 녹인다.

3) 호일로 입구를 막고 멸균테이프를 붙인 후, 멸균기에 넣고 121℃에서 15분간 멸균한다.

4) plate에 배지이름을 적고, 클린벤치 안에서 plate에(약 12장) 배지를 약 2/3씩 붓고 뚜껑을 덮고 굳힌다.

5)약 2~3일정도 상온에서 보관한 후, 습기가 없어지지 않도록 랩으로 싼 후 뒤집어서 4℃에서 보관하다.

2.YPD 배지 만들기

1) 삼각플라스크에 증류수 300ml을 넣는다.

2) 삼각플라스크에 yeast extract 3g, peptone 6g, glucose 6g, Agar 4.5g을 각각 넣고 녹인다.

3) 호일로 입구를 막고 멸균테이프를 붙인 후, 멸균기에 넣고 121℃에서 15분간 멸균한다.

4) plate에 배지이름을 적고, 클린벤치 안에서 plate에(약 12장) 배지를 약 2/3씩 붓고 뚜껑을 덮고 굳힌다.

5)약 2~3일정도 상온에서 보관한 후, 습기가 없어지지 않도록 랩으로 싼 후 뒤집어서 4℃에서 보관하다.

고체 아가 배지 만들기

3. 균접종, 사분도말 및 배양

1) plate에 균이름, 날자, 배지, 실험자 이름을 적는다

2) 알코올램프를 이용하여 루프를 멸균 후 공기 중에서 식힌다.

3) 균 배양체를 루프를 이용하여 취한다.

4) plate에 1번 부분에 도말한다.

5) 루프를 살짝 멸균하다.

6) 균이 도말된 1번 부분에서 2번 방향으로  도말한다.

7) 루프를 살짝 멸균한다.

8) 3번방향과 4번방향으로 연속 도말한다.

9) plate를 랩으로 싼 후 뒤집어서 유산균은 25℃, 대장균은 37℃에서 배양한다.

※ 주의: 본 실험에서는 금속으로 된 루프를 사용하지 않고 멸균된 일회용 플라스틱 루프를 사용함. 따라서 루프를 불에 화염 멸균시키지 않고, 한 차례만 루프를 이용하여 아가 배지 위에 줄을 그어 접종한다.

(금속 루프는 조교가 시범으로 보임)